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大肠杆菌转化

在使用Stbl3感受态时怎样提高病毒质粒的产量?

文字:[大][中][小] 2016-6-6    浏览次数:1757    

在使用Stbl3感受态时怎样提高病毒质粒的产量?

答:Stbl3菌株基因组中核酸内切酶A1基因(endA1+)为野生型,没有被突变。在质粒提取过程中,微量的endA1与质粒一起被提取,导致质粒降解。为了提高Stbl3菌株中的病毒质粒产量,可采用以下方法:

A,使用商业化的高纯度质粒提取试剂盒(推荐:QIAGEN #12362 EndoFree Plasmid Maxi Kit)。如使用其他公司产品,务必使用去蛋白液去除细胞内核酸酶对质粒的污染。

B,使用质粒提取溶液Ⅰ,,Ⅲ提取质粒时,确保溶液Ⅰ中含有10mM的EDTA(EDTA可使endA1失活),并且用酚/氯仿/异戊醇溶液多抽提几次,尽量去除残留的endA1。

C,接菌时用新鲜的菌斑,不要使用4℃保存的菌落接菌,摇菌时用大体积容器,300 rpm,增加溶氧量。

例如:小提质粒时,50 ml离心管中接入6 ml LB菌液,羧苄青霉素50 µg/ml,接新鲜克隆,37℃,300rpm  摇菌20小时;大提质粒时,2L离心瓶中接入200ml LB菌液,羧苄青霉素50 µg/ml,接新鲜克隆,37℃,300 rpm摇菌20小时。

D,对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存,尽量避免将质粒保存在大肠杆菌细胞中。对摇好的菌液应立即提取质粒,不可将菌液在室温或低温放置一段时间后提取质粒。

E,用Stable菌株代替Stbl3扩繁病毒质粒,Stable菌株与Stbl3相比,基因组含有endA突变,提取的质粒中无核酸内切酶污染,提高了病毒质粒的产量和纯度,同时具有Stbl3菌株的优点,可降低病毒质粒错误重组的概率(唯地生物:Stable感受态细胞  /info.asp?third_id=88)。

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